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液体活检技术在非小细胞肺癌患者EGFR-TKI继发耐药中的应用 非小细胞肺癌耐药

放大字体  缩小字体 发布日期:2016-11-15  来源:检验医学杂志  作者:林铖, 姜傥  浏览次数:461
核心提示:作者:林铖1, 姜傥2单位:1.杭州迪安医学检验所, 2.中山大学附属第一医院肺癌是危害人类健康的重大疾病, 是最常见的肿瘤相关性死亡的原因, 并且在全球范围内其发病率仍呈现上升趋势。仅2015年, 我国肺癌发病人数就达
作者:林铖1, 姜傥2
单位:1.杭州迪安医学检验所, 2.中山大学附属第一医院


肺癌是危害人类健康的重大疾病, 是最常见的肿瘤相关性死亡的原因, 并且在全球范围内其发病率仍呈现上升趋势。仅2015年, 我国肺癌发病人数就达73.33万, 死亡人数达61.02万[1, 2]。肺癌的发病增加与现代社会人口老龄化加剧、城市工业化、环境污染及不良生活方式如吸烟等相关。约有50%的肺癌患者在确诊后1年内死亡, 5年生存率极低。按照组织学分型, 可将肺癌分为小细胞肺癌及非小细胞肺癌, 非小细胞肺癌又可继续划分为腺癌、鳞癌、大细胞分化癌及混合细胞肺癌, 并且其发病率约占所有肺癌的80%[3, 4]。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)-酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI)的出现显著延长了非小细胞肺癌患者的生存期, 改善了患者的生存质量。然而, 分子靶向药物面临的一个重要问题就是耐药。由于EGFR-TKI的继发耐药, 目前已经相继出现3代EGFR-TKI药物。为了达到更好的治疗效果, 使用EGFR-TKI药物的患者必须对继发耐药进行动态监测。液体活检是一种方便、快捷、具有较高可靠性、新兴的非侵入性检测方法。我们对液体活检技术在非小细胞肺癌患者EGFR-TKI继发耐药中的应用进行了综述。

一、非小细胞肺癌基因检测的应用

随着人类基因组计划的完成, 人类30亿碱基对的遗传密码已经初步得到破解, 同时伴随着分子生物学检测技术, 如聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)、荧光原位杂交(fluorescence in situhybridization, FISH)、一代测序、二代测序等技术的逐步成熟, 基因诊断已经在遗传性疾病、肿瘤、感染性疾病、生育健康指导等多个领域中得到了广泛应用, 个体医疗已经进入“ 精准医疗” 时代。目前, 基因诊断已经被越来越多地用于指导肿瘤早期筛查、用药指导、预后判断及微小残留监测等。通过对肿瘤的基因诊断, 能够实现肿瘤的基因分型, 实现肿瘤的异癌同治以及同癌异治。

肿瘤靶向药物的出现在很大程度上改变了肿瘤的传统治疗模式, 大大改善了患者的预后, 显著延长了患者的无进展生存期和总生存期。这些靶向药物主要为单克隆抗体类和一些小分子的激酶抑制剂, 作用机理往往是抑制肿瘤新生血管生成、影响细胞周期、阻断异常的细胞信号转导通路及对表观遗传改变进行调控[5]。

目前, 针对非小细胞肺癌已经发现了多种驱动突变, 这些突变包括EGFR、KRAS、间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)、ROS1、HER-2、BRAF、RET等[6, 7]。针对携带这些突变的非小细胞肺癌患者可选用相应的分子靶向药物进行治疗, 如靶向EGFR突变的TKI药物, 靶向ALK、ROS1、RET突变的克唑替尼(crizotinib), 靶向BRAF突变的威罗菲尼(vemurafenib)/达拉菲尼(dabrafenib), 靶向KRAS突变的司美替尼(selumetinib)等[5, 8]。对于未经选择的非小细胞肺癌患者, SCHILLER等[9]的研究结果显示4种化疗方案(卡铂/紫杉醇、顺铂/吉西他滨、顺铂/紫杉醇、顺铂/多西他赛)的总体生存期为8个月。对于根据临床特征选择的非鳞癌患者, SCAGLIOTTI等[10]的研究显示应用培美曲塞/顺铂进行化疗的中位生存期为11.8个月。而对于EGFR基因敏感突变的患者, MITSUDOMI等[11]的研究结果显示, 其中位生存期已经延长到30.9个月。 晚期非小细胞肺癌的治疗模式已逐渐从以往的千篇一律发展到今天由基因诊断和靶向治疗引领的个体化治疗时代, 而其中最关键的生物标志物就是EGFR基因突变, 它让患者能在TKI药物的治疗中实现长期生存。

二、EGFR-TKI药物的应用现状

在非小细胞肺癌患者的驱动突变中, 突变比例最高的当属EGFR。EGFR属于ErbB受体家族, 该家族包括EGFR(ErbB-1)、HER-2/c-neu(ErbB-2)、HER-3(ErbB-3)和HER-4(ErbB-4)。EGFR基因也被称作HER-1(ErbB1)基因, 是一种癌基因。EGFR是一种受体酪氨酸激酶, 位于细胞膜上, 通过与细胞外的配体如表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)等结合后激活并发生二聚化, 通过磷酸化激活下游信号通路, 实现信号的传递, 并最终影响细胞增殖及肿瘤发生、转移、放化疗抵抗等[12, 13]。EGFR突变主要集中在酪氨酸激酶区, 具体位置为第18~21号外显子, 其中19号外显子部分缺失(19del)以及21号外显子L858R点突变, 约占EGFR所有突变的90%, 而突变的EGFR往往会使该信号通路异常激活, 导致肿瘤发生[12, 14, 15]。在白种人非小细胞肺癌患者中, EGFR突变比例约为20%; 在亚洲非小细胞肺癌患者中, EGFR的突变率约为50.2%; 而在不吸烟的患者中, 其突变比例甚至高达60.7%[16, 17]。目前, 国内外权威指南均提出, 针对非小细胞肺癌, 需要检测EGFR的突变状态。

靶向EGFR的EGFR-TKI药物用于治疗非小细胞肺癌已经有10多年的经验, 极大地提高了非小细胞肺癌患者的总生存期。目前, EGFR-TKI药物已经发展了3代, 其中第1代EGFR-TKI药物以吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)为代表, 作用机理为通过竞争性结合EGFR-酪氨酸激酶催化区域上的ATP结合位点, 阻断信号传递。第1代EGFR-TKI药物与EGFR的结合是一种可逆的结合过程[18]。大量临床研究表明, 非小细胞肺癌患者使用第1代EGFR-TKI药物后的无进展生存期为9~13个月, 之后发生耐药, 其中约有50%~60%的患者发生EGFR第20号外显子T790M点突变, 其他耐药机制还包括EGFR的其他突变(D761Y、T854S、L747S等)及MET基因扩增、HER-2基因扩增、MAPK扩增、PIK3CA突变、BRAF突变、EMT(上皮向间质细胞转化)、转变为小细胞肺癌(small-cell lung cancer, SCLC)、AXL通路激活, 核因子-κ B(nuclear factor-kappa B, NF-κ B)激活等[19, 20, 21, 22]。针对T790M突变, 研发出了第2代EGFR-TKI药物及第3代EGFR-TKI药物, 第2代EGFR-TKI药物以阿法替尼(afatinib)为代表, 其原理与第1代EGFR-TKI类似, 但与EGFR-TKI的结合是不可逆的, 并且能够和多种EGFR家族成员结合。然而, 由于第2代EGFR-TKI靶向T790M的特异性不强, 并且能够和多种野生型EGFR基因结合, 耐受剂量低, 不良反应较强, 因此并未达到理想的效果[23]。第3代EGFR-TKI药物以奥斯替尼(osimertinib/AZD9291)为代表, 能够靶向EGFR的激活突变位点及T790M, 竞争性结合EGFR-酪氨酸激酶催化区域上的ATP结合位点, 阻断其信号传递。其优势在于这种结合是不可逆的, 并且只能和突变的EGFR结合, 而对野生型EGFR不发生作用。 然而, 第3代EGFR-TKI药物仍然无法逃离靶向药物耐药的宿命, 患者的无进展生存期在1年左右, 部分患者产生了新的耐药突变C797S[24, 25, 26, 27]。目前, 针对C797S的药物正在研发中。最新的研究表明, 将一种小分子药物EAI045与爱必妥联用, 能够在小鼠模型中显著抑制EGFR L858R/T790M/C797S突变的非小细胞肺癌细胞的增殖, 有望发展为第4代EGFR-TKI药物[28]。

由于非小细胞肺癌患者能够极大获益于EGFR-TKI药物的治疗, 对于这些患者进行基因诊断十分必要。组织活检作为肿瘤的标准诊断流程, 能够提供样本用于基因诊断, 以决定该患者是否适用靶向药物。但由于组织活检存在有时无法进行、操作风险较高、无法获得组织样本、无法实时检测患者的基因突变状态等问题, 甚至由于肿瘤存在异质性, 获得的部分组织样本无法正确反映肿瘤的突变等情况, 非小细胞肺癌的突变检测亟需一种方便、快捷、特异、无创或微创的检测方法。

三、液体活检技术

近年来, 液体活检技术取得了巨大进步。作为一种新兴的检测方法, 液体活检由于其非侵入性、方便、快捷和较高的可靠性等优点已越来越多地被应用于临床, 并且具有很大的发展潜力。只需要对肿瘤患者进行简单的采血就能实现实时、重复地检测肿瘤脱落进入血液的循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)及外泌体[29, 30, 31]。通过液体活检, 医生能够建立肿瘤基因表达谱、靶向突变用药、及时判断治疗是否有效、动态调节治疗方案等。对于非小细胞肺癌患者而言, 液体活检技术能够用于肿瘤的早期筛查、疗效和预后评估以及耐药检测等, 具有传统组织活检不具备的诸多优势[32]。

四、CTC

1869年, 澳大利亚学者ASHWORTH[33]首次在转移性肿瘤患者的血液中观察到肿瘤细胞, 并率先提出了CTC的概念。CTC被认为是自发或经由诊疗操作, 脱离实体肿瘤或转移癌进入外周血的肿瘤细胞[34]。CTC进入血液可能是经由肿瘤内部破溃的血管、经由上皮向间质细胞转化或主动发生迁移, 进入外周血中[35, 36]。CTC在外周血中以单个细胞或细胞团的形式存在[37]。CTC在肿瘤患者外周血中的含量很低, 往往105~107个白细胞中才存在1个CTC[38]。随着CTC检测分离和检测技术的进步, 目前CTC检测已被应用于临床。实现CTC检测首先需要将其与血液中的各种细胞进行区分, 然而目前尚无方法能够十分可靠并且高效地将CTC从血液中分离出来。实现对CTC的分析需要特殊的分离方式和有效的检测手段。目前, CTC的分离方式主要有根据细胞的物理性质, 如细胞大小、密度等(密度梯度离心法、微孔过滤法)进行分离; 根据细胞的生物学特性, 使用免疫磁珠进行分离(针对CTC细胞表面抗原的正向分选以及针对白细胞表面抗原的负向分选); 通过微流控芯片进行CTC分离等[39, 40, 41, 42, 43]。

当成功分离CTC后即可对其进行检测。目前, CTC的检测方式主要有:针对细胞数量的细胞计数, 基于基因检测的免疫荧光、FISH、测序、逆转录(reverse transcription, RT)-PCR和表达分析以及细胞培养等。CellSearch是全球第1个获得美国食品药品管理局(U.S. Food and Drug Administration, FDA)认证的用于恶性肿瘤疾病管理的CTC检测产品。目前, 已经有多项研究结果表明CTC计数能够作为乳腺癌、前列腺癌以及结直肠癌的预后指标[44]。在黑素瘤[45]、头颈癌[46]等肿瘤中, CTC也被认为具有指示预后的效果。在治疗过程中, CTC的数量变化能为治疗效果的评价提供参考。患者在经过治疗后, 如果CTC数量急剧下降, 往往会有更好的预后[47, 48] 。对于非小细胞肺癌患者, CTC的数量也与肿瘤的预后直接相关[49]。对于早期肺癌患者, 术前检测到的CTC数量越多, 则肿瘤的无进展生存期及总生存期越短[50, 51]。目前, 使用CTC已经能够检测多种突变, 包括EGFR、KRAS、ALK、ROS1、c-MET等, 并且能够用于EGFR-TKI继发耐药的用药监测, 有助于肿瘤个体化治疗药物的选择以及治疗方案的确定。

MAHESWARAN等[52]采用微流控芯片从27例非小细胞肺癌患者血液中分离CTC(中位数为74个/mL), 并通过扩增突变阻滞系统(amplification refractory mutation system, ARMS)-PCR检测EGFR的突变状态, 在采用EGFR-TKI治疗的患者体内发现了T790M突变, 并且T790M突变的出现明显缩短了患者的无进展生存期。而在一项针对40例EGFR-TKI继发耐药患者的研究中发现, 通过CTC检测, 约有80%的患者能够检出与组织活检相同的T790M突变[53]。在另一项研究中, 研究者通过激光显微切割技术分离CTC, 通过全基因组扩增, 继而使用PCR检测EGFR 19del、EGFR L858R及EGFR T790M的突变状态。结果表明95%(19/20)的单个CTC能够产生至少1种EGFR突变的扩增子, 其中有55%(11/20)成功产生了检测EGFR 19del的扩增子, 85%(17/20)成功产生了检测EGFR L858R的扩增子, 45%(9/20)成功产生了检测EGFR T790M的扩增子[54]。

目前, CTC的应用仍然具有一定的局限性, 包括检出率低(尤其是在肿瘤早期, 检出率极低)、需要依赖于特殊的分离设备、不同的分离方式影响CTC的纯度、需要通过单细胞测序技术对全基因组进行分析、肿瘤存在异质性、检测的CTC不能代表整个肿瘤的状态等。目前, 液体活检技术用于非小细胞肺癌EGFR-TKI继发耐药的监测时, 更多检测的是ctDNA。

五、ctDNA检测

1948年, Mandel和Mé tais发现在外周血中存在大量的游离DNA(cell-free DNA, cfDNA), 这些cfDNA来自于自体细胞破溃。而在数十年后, 人们才在肿瘤患者血液中确定存在肿瘤特异的DNA, 即ctDNA[55, 56]。ctDNA被认为是肿瘤细胞凋亡、坏死及分泌所释放出的DNA[57], 其在肿瘤患者体内的含量很低, 约占整个cfDNA的1%, 甚至只有0.01%[58]。同时, ctDNA的半衰期很短, 只有数小时, 因此可以用于对肿瘤患者进行实时监控[59]。ctDNA的片段大小也有较固定的特征, 多为核小体的整数倍, 主要集中于160~180 bp[60]。ctDNA的富集对于其分析具有明显影响, 通过使用磁珠特异性的收集小片段核酸能够实现ctDNA的富集, 而使用探针进行靶向捕获或使用特定引物进行靶向扩增能够对染色体的特定区域进行富集并检测。

在多种实体肿瘤中存在ctDNA。研究表明检测肿瘤患者体内ctDNA的水平能够用于评估肿瘤负荷、监测复发及评估治疗的有效性[61, 62]。由于ctDNA占整个cfDNA的比例极低, 检测存在大量的背景噪声, 需要使用更加灵敏的检测方式, 如基于PCR技术的ARMS-PCR、BEAMing、数字PCR, 基于下一代测序技术及PCR技术的标记扩增深度测序、安全测序系统、超高多重PCR捕获测序等以及通过靶向捕获, 如癌症个体化深度测序分析(cancer personalized profiling by deep sequencing, CAPP-Seq)等。通过对ctDNA进行检测, 能够发现肿瘤特异的基因改变, 如点突变、插入/缺失、拷贝数变异、染色体重排甚至是表观遗传学改变[63, 64]。

六、ctDNA在EGFR-TKI继发耐药监测中的应用

目前, 关于ctDNA用于EGFR-TKI继发耐药的监测已有较多实践经验。TANIGUCHI等[65]在针对肺腺癌继发耐药的研究中, 通过一种基于数字PCR原理的BEAMing技术对ctDNA进行检测, 结果显示43.5%(10/23)的肺腺癌患者产生了EGFR T790M突变。ZHENG等[66]采用数字PCR对使用EGFR-TKI药物的非小细胞肺癌患者的ctDNA进行检测, 结果显示在117例EGFR-TKI继发耐药的患者中, 有47%(55/117)的患者发生了EGFR T790M突变, 并且在EGFRT790M阳性和阴性的继发耐药患者中, 年龄、性别、组织学、吸烟史及EGFR-TKI作为几线药物治疗等方面均无明显差异。在一项关于厄洛替尼的2期临床试验中, 招募了60例患者, 每2个月及肿瘤进展时抽取患者血液, 使用数字PCR检测EGFR 19del、EGFR L858R及EGFR T790M的突变状态, 最终有44例患者的肿瘤发生进展, 其中有35例可再次活检, 发现有66%(23/35)的患者发生了EGFR T790M突变; 有39例患者通过数字PCR检测ctDNA, 有23%(9/39)的患者也发现了EGFR T790M突变; 值得一提的是有2例无法再次活检的患者通过ctDNA检出了EGFR T790M突变[67]。在另一项针对第3代EGFR-TKI药物— — 诺司替尼(rociletinib)继发耐药的43例非小细胞肺癌患者的研究中, 通过CAPP-Seq检测ctDNA, 发现有46%的患者产生了多种耐药机制, 提示存在肿瘤异质性, 同时发现了新的耐药突变EGFR L798I, 该研究还发现在奥斯替尼耐药的患者中, EGFR C797S突变占33%, 而在诺司替尼继发耐药的患者中这种突变仅占3%左右[68]。在一项通过ctDNA检测非小细胞肺癌患者EGFR突变的研究中, 研究者比较了基于非数字PCR的CobaseGFR Mutation Test和therascreen EGFR amplification refractory mutation system assay平台以及基于数字PCR的Droplet Digital PCR和BEAMing digital PCR, 结果显示, 对于EGFR T790M突变, CobaseGFR Mutation Test的敏感性和特异性分别为73%和67%, 而BEAMing digital PCR的敏感性和特异性分别为81%和58%[69]。

目前, ctDNA在临床上的应用仍然具有一定的局限性, 包括含量很低, 尤其在癌症早期, 其含量更低; 依赖于高灵敏度的检测手段; 无法检测蛋白质, 导致核酸的检测结果无法与蛋白质共定位; 无法进行活细胞功能研究等。

七、外泌体

外泌体是由细胞内部的多泡体与细胞膜融合后, 释放到细胞外基质中的一种直径为30~120 nm的膜性囊泡, 在多种疾病及多种体液, 如血液、尿液、母乳、腹水、唾液中均能检出。外泌体内含物大部分是蛋白质, 如膜联蛋白、CD9、CD63、CD81、主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)-1和肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101, TSG101)蛋白等, 同时含有大量的mRNA、微小RNA(microRNA, miRNA)、长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA))和环状RNA(circular RNA, circRNA)[70, 71]。在肿瘤细胞产生的外泌体中可检测到过度表达的蛋白标志物, 如死亡受体Fas配体、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)和转化生长因子-β (transforming growth factor-beta, TGF-β )等肿瘤抗原和免疫抑制蛋白。肿瘤细胞分泌的外泌体具有多种功能, 包括导致肿瘤发生[72, 73]、影响血管生成/内皮细胞活化[74, 75]、肿瘤增殖[76, 77]、肿瘤侵袭/转移[78, 79]以及免疫逃逸[80]等。外泌体的分离方法有很多, 超速离心、密度梯度离心、免疫磁珠、微流控芯片等均能将外泌体从血液中分离[81, 82, 83]。而外泌体中携带的蛋白及RNA能够用于肿瘤的早期诊断、预后判断及耐药评估, 如随着疾病的恶化, 胃癌患者外泌体的数量会增加[84]。通过对肺癌患者血液及尿液的外泌体进行富集, 检测其中的蛋白质及miRNA, 能够实现对肺癌的诊断及预后判断[69, 85, 86, 87, 88, 89, 90]。

虽然对于外泌体的研究已经有数十年的历史, 然而外泌体在肿瘤诊断中的应用仍是一个较新的领域。目前, 外泌体在临床上的应用仍具有一定的局限性, 包括其分离需要特殊设备、无法进行细胞功能研究、使用的靶标还需要大样本研究确定其与肿瘤的相关性, 并且对于外泌体本身的形成和分泌等机制仍需要更深入的研究。目前还没有关于外泌体应用于EGFR-TKI继发耐药监测的文献报道, 而美国Exosome Diagnostics公司声明将于今年推出肺癌外泌体活检产品— — ExoDx Lung(T790M)和ExoDx Lung(EGFR)。

八、总结

作为《麻省理工大学科技评论》评选出的“ 2015年度十大突破技术” 之一, 液体活检技术已得到科研工作者及临床医疗机构越来越多的关注。虽然目前国内外的液体活检技术产业仍然处于初级阶段, 然而由于其具有非侵入性、方便、快捷和可靠性较高等优点, 液体活检技术将在肿瘤的伴随诊断、预后判断、微小残留及筛查等方面扮演越来越重要的角色。而随着更加高效、特异的CTC、ctDNA及外泌体分离方式的出现以及检测技术的进步和新靶标的发现, 液体活检技术必将惠及更多的肿瘤患者, 并在非小细胞肺癌患者EGFR-TKI继发耐药的动态监测中大放异彩。

参考文献略
 
 
 
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