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“分子诊断万花筒”——新型双向置换荧光探针

放大字体  缩小字体 发布日期:2016-11-06  来源:分子诊断万花筒  作者:网络来源  浏览次数:504
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随着化学合成核酸技术的不断发展,利用核酸探针进行相关研究已成为当今生物和医学领域常用分子生物学技术之一。核酸荧光探针则是对特定的核酸探针进行荧光基团标记,通过记录荧光信号的变化来分析和检测对应目标分子的一种核酸探针形式。作为最常用的信号转导媒介,核酸荧光探针具备分析灵敏度高、检测手段简单和对生物分子影响较小等优点,现已用于检测蛋白质分子、核酸片段分子、生物小分子和无机离子等。到目前为止,核酸荧光探针多为寡核苷酸探针,长度一般在18~50个碱基之间,如TaqMan探针、分子信标(Molecular beacon)探针、相邻探针等。

TaqMan探针是核酸扩增中使用最为广泛的一种核酸荧光探针类型,常用于实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR),以实现高灵敏、高特异性的核酸定量检测。在TaqMan荧光探针中,寡核苷酸的5'末端标记有荧光报告基团,而3'末端连有淬灭基团。当探针处于完整状态时,报告基团被激发的荧光信号被淬灭基团所吸收,表现为荧光淬灭。随着qPCR的进行,Thermus aquaticus DNA聚合酶(Taq酶)的5'-3'外切酶活性(即具有5'-3'方向水解磷酸二酯键活性)将识别上模板的探针水解酶切而打破了探针的完整性,使荧光基团和淬灭基团分离,表现为荧光生成,并通过监测所生成的荧光信号,来实现信号的累积与qPCR产物形成的实时同步。TaqMan探针虽然被广泛应用于生物和医学相关的检测研究,但仍存在不足,主要体现在背景荧光值较高,因为荧光共振能量转移的效率易受寡核苷酸长度影响。此外,TaqMan探针不能应用到以Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶(Bst酶)链置换活性构建的核酸等温扩增方法中,因为Bst酶缺乏5'-3'的外切酶活性,无法酶切水解识别上模板的核酸链。
“分子诊断万花筒”——新型双向置换荧光探针
图 1 TaqMan探针用于SNP位点的检测(Bass C, Nikou D, Vontas J, et al. Malaria Research & Treatment, 2010, 2010(2):190434-190434.)

同TaqMan探针类似,分子信标探针也是在两端分别标有荧光基团和淬灭基团的寡核苷酸链,但其一般呈茎-环结构,包含15~30个碱基的目标识别区(与目标序列互补)和两端自身互补配对的茎部。无目标序列时,分子信标两端标记的荧光基团由于配对与淬灭基团相近而被淬灭;当目标序列存在时,环与目标序列杂交配对,破坏其茎部双链,导至两端分离和荧光淬灭消失。分子信标探针的荧光共振能量转移效率较高,可实现对目标物的高灵敏、高特异的实时监测,但是该探针的设计要求高,需要相对繁琐的优化过程。虽然信标探针可应用于等温扩增检测,但由于酶的链置换作用,仪器所记录的荧光信号实质是一种混合信号,即识别目标时产生的正信号和被置换后再次呈茎-环结构时的负信号的信号净值,无法真正实时同步扩增产物的形成。
“分子诊断万花筒”——新型双向置换荧光探针
图 2 分子信标在PCR各阶段的形态:①热解链阶段;②退火阶段;③延伸阶段;(摘自维基百科)

相邻探针则是由两条标记的寡核苷酸链组成,其中一条标有荧光基团,另一条标有淬灭基团。无目标DNA分子存在时,探针处于游离状态,具有很强的荧光信号。当目标DNA分子不断累积时,两条探针在相邻位置处与目标DNA互补,其末端标记的荧光基团由于距离靠近被相邻的淬灭基团所淬灭,通过荧光信号的显著降低来分析目标分子。然而,相邻探针也存在荧光共振能量转移效率低、背景信号偏高、设计高效探针难度大的缺点。而且,相邻探针很难被应用于核酸等温扩增检测,需要对其3'端进行化学修饰以阻断延伸。
“分子诊断万花筒”——新型双向置换荧光探针
图 3 相邻探针作用机理示意图(Nature Reviews Drug Discovery 2004, 3, 749-761)

上述核酸荧光探针均属额外添加物,即既不参与扩增,也不引导扩增,只充当信号放大的媒介。因此, 在核酸扩增,尤其是核酸等温扩增技术中,研究人员不仅要设计高效扩增所用的引物,还要合理设计信号指示用的荧光探针,这一定程度上增加了设计整体难度。基于此,一种新型的荧光探针——双向置换荧光探针(Fluorogenic bidirectional displacement probe,FBD探针,专利号
201610227096 .4)近日被浙江大学研究者设计出(Ding,X.; Wang, G.-P..; Sun, J.-J.; et al. Chem.Commun. 2016, 52, 1143811441.),如图4所示。
“分子诊断万花筒”——新型双向置换荧光探针
图 4 FBD探针结构示意图。FBD探针无须独立设计,只需将等温扩增体系中的两条5端互补的混合式内引物标记相应的基团,再预退火即可。

对比以往的探针,除了结构设计简单、方便,双向链置换探针最大的优势在于,在扩增过程中既充当引物促发并介导再循环扩增,又同步实时显示扩增信号,可用于扩增产物的实时荧光检测和特异性荧光显色检测,如图4所示。
“分子诊断万花筒”——新型双向置换荧光探针
图 5 FBD探针介导的实时等温DNA扩增和特异性双荧光显色产物检测

该特异性荧光显色产物检测是通过将FAM基团标记的双向置换探针和钙镁离子指示剂羟基萘酚蓝(HNB)共混建立起来的,其阴阳性之间的荧光强度差异对比TaqMan探针介导的qPCR而言效果非常明显,极大地满足了微小体积下核酸扩增反应的信号检测。对乙肝病毒S蛋白基因序列进行扩增检测的结果表明该荧光显色检测具备快速(不到两小时)、高特异性、高灵敏度(最低可检测40 copies/μL目标核酸分子)、显色效果肉眼易分辨的优点,可用于食源性细菌、转基因成分、传染性病原体、临床疾病生物标记物等检测,也可作为POCT分子诊断装置所需试剂盒,以及在芯片式或液滴式数字检测技术上的应用。
 
 
 
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