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手把手教你获得高质量ccfDNA ccfdna

放大字体  缩小字体 发布日期:2016-10-07  来源:凯杰生命科学  作者:网络来源  浏览次数:1336
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手把手教你获得高质量ccfDNA
近几年,液体活检中的一个重要研究方向——循环游离核酸(ccfDNA)进展迅猛。ccfDNA最早是应用于无创产前检测,目前已成为了癌症研究中的热点之一。随着相关技术的不断进步以及诸多血浆中生物标志物的发现,未来可通过对ccfDNA中特定生物标志物的检测及筛查,为肿瘤治疗及器官移植等领域带来令人瞩目的变革。目前ccfDNA相关的新技术在一些实验室刚刚开展起来,针对这一新的分析对象,不可避免地面临着需要将可用的技术向实验室标准化流程转化的挑战。

ccfDNA研究中的挑战
对ccfDNA的研究首先需要面临的挑战是对所分析样本的稳定保存。这不仅是成功开展下游检测的先决条件,也是确保检测结果可靠的重要因素;其次,ccfDNA在血浆中的含量很低(1-100 ng/ml 血浆),且采血后凋亡的白细胞会释放出gDNA,从而稀释和污染了ccfDNA的原始组分。因此样本保存和高效提取是获得高品质ccfDNA不可或缺的两个方面。

ccfDNA分析中如何采集血液样本?目前在ccfDNA分析中的血液采集主要有两种选择:1. 采用EDTA采血管2. 采用专门针对ccfDNA保存的特殊采血管
这两种选择在样本处理的流程上有很大不同:
采用EDTA管采血后,样本须在4°C储存,且需要在采样后极短时间内完成对血浆的分离,以避免发生溶血或gDNA的释放。这对采血后样本的处理及运输的要求非常严格。而实际情况中,这一要求往往很难实现,所以选择专门用于稳定ccfDNA的采血管就显得十分必要了。这种采血管最大的特点是从采血至血浆分离前,全血样本可在室温稳定储存数日之久。

如何选择针对ccfDNA保存的采血管?在选择合适的ccfDNA采血管时,为确保实验的可靠性和可操作性,需要考虑以下几点:1. 采血管的材质2. 采血管中稳定剂的性能3. 稳定剂中的成分是否与下游应用兼容4. 分离出的血浆可否便捷地对接已确定的游离核酸提取方案
采血管的材质
目前市面上的采血管主要有玻璃和塑料两种材质。在实际操作时,玻璃管破碎的概率往往比我们想象的要大得多。除了在运输过程中可能会发生破裂,在离心阶段也得极为小心。破碎后,除了样本本身的损失外,还要额外花费很大功夫去消除样本泄露可能带来的污染,对于实验操作者来说也具有较大的安全风险。因此,在使用玻璃采血管时,操作者为了保险起见,同一份样本一般会采集两管,以应对在运输和离心时的突发状况。
真空采血管的采血量及采血速度取决于采血管的真空技术。目前市面上的真空采血管的进血流速有快有慢。较慢的流速可能会造成采血者在采血量达标前提前终止采血,极大增加了样本体积收集不足的风险。此外,管子的密封技术也十分重要。最新的采血管会在管塞外搭配特殊的安全管盖,这一科学的设计不但保护了采血者的安全,而且极大降低了开管时样本飞溅导至的交叉污染。

稳定剂的性能
采血管中稳定剂的性能是一个重要考量方面。目前的一些性能较好的采血管都可在室温保存样本一周,高温条件下(例如35°C)至少保存24小时,有效避免游离核酸降解、溶血以及白细胞基因组DNA污染等情况的发生。

与下游应用的兼容性
选择采血管时需要针对下游应用做出选择。采血管的稳定剂中如果存在会引起核酸交联的福尔马林类似物,则会影响到下游的核酸提取效率以及如甲基化的多方面检测。不同采血管预防溶血的能力也有所不同。较高的溶血水平会影响血浆、白膜层和红细胞的分层结果,会直接降低分离出的血浆样本的质量。溶血程度同样影响着进行血浆分离的步骤。有效预防溶血的采血管可减少分离血浆的离心时间,加速实验进程。更为重要的是,如果采血管中的稳定剂不能有效防止白细胞的凋亡,其释放出的gDNA背景会严重影响下游对ccfDNA检测的准确性。

与提取方案的对接
最后,需要注意的是所选的采血管与下游ccfDNA提取方案的对接。一些采血管与提取试剂的组合可能需要一些预处理步骤,例如蛋白酶K的处理;或者需要对提取步骤做出一些调整,比如裂解时孵育时间的过度延长。可想而知,预处理或提取流程的变更会延长实验时间并提高提取成本。目前市场上已有一些采血管可轻松对接下游手工法或自动化的提取方案而无需任何附加或修改,这为检测前的样本保存和血浆分离流程提供了新的选择。
随着技术的不断进步,已有越来越多的方案是为某些特殊实验需求而量身打造的。在选择琳琅满目的采血管时,只需注意产品特点及流程细节,您就可能找到一款省时划算,并确保下游分析结果可靠性的产品用于您ccfDNA的项目。
说了这么多,小编已按耐不住激动的心情要为您介绍一款针对ccfDNA保存的专用采血管了,这就是QIAGEN新推出的

PAXgene Blood ccfDNA Tubes
手把手教你获得高质量ccfDNA

这款针对ccfDNA的特殊采血管,采血体积最高可达10ml。材质选用了特殊处理的高硬度透明塑料,可对抗运输过程中的撞击。该采血管采用的是一种非交联反应的稳定剂,可有效防止溶血及gDNA的释放,最大程度减少对于ccfDNA的改变。采集的全血可在室温(8-25°C )放置7天,极端高温条件如35°C时也还可以安全保存24小时。一旦分离好了血浆,下游可无缝对接QIAGEN著名的ccfDNA手工法提取试剂盒QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit以及可在QIAsymphony全自动工作站上进行完全自动化提取。提取的ccfDNA,可直接应用于多种下游检测,不论是NGS、PCR、SNP分型还是ccfDNA甲基化的检测
 
 
 
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